خلاصه

دراین مطالعه اثرات سودمندی احتمالی اضافه کردن ژلاتین به رقیق کننده پایه شیر ، برای ذخیرة جامد منی گوسفند در ºc15 مورد ارزیابی قرار گرفت. آزمایش اول اثرات ذخیرة جامد روی تحرک و سلامت غشا در طی دورة دو روزه و آزمایش دوم ظرفیت نفوذ پذیری اسپرم بعد از 24 ساعت ذخیره در شرایط آزمایشگاهی را مورد بررسی قرار داد. در هر دوی آزمایشات از رقیق کننده شیر (به عنوان شاهد) وژل(5/1 گرم ژلاتین در 100 میلی لیتر رقیق کننده) استفاده شد و غلظت نهایی اسپرم 106×400 بدست آورده شد. در آزمایش اول بعد از ذخیرة منی در ºc 15 ، تغییرات کیفی اسپرم بعد از 24،2 و 48 ساعت مورد آنالیز قرار گرفت.تحرک و زنده مانی در روش ذخیرة مایع در مقایسه با رقیق کننده ژلی به طور معنی داری در همة دوره های زمانی، به استثنای دو ساعت بعد از ذخیره شدن کاهش یافت. طی دو ساعت انکوباسیون در ºc 37 ، درصد سلول های متحرک واسپرم های با غشاهای سالم در گروه شاهد نسبت به گروه ژل در همة دوره های زمانی به طور معنی داری پائین بود. اووسیت ها بطور تصادفی در سه گروه قرار گرفته و بوسیلة منی رقیق شده با شیر و منی رقیق شده با ژل بارور شده و به ترتیب برای 2 یا 24 ساعت (در مورد رقیق کننده اول) و 24 ساعت (در مورد رقیق کننده دوم) ذخیره گردیدند. بعد از انکوباسیون، اووسیت ها جهت اثرات نفوذپذیری مورد ارزیابی قرار گرفتند.ذخیرة منی در رقیق کننده ژل (24 ساعت) نسبت به رقیق کننده گروه شاهد، باعث افزایش نرخ باروری در شرایط آزمایشگاهی می شود. این مطالعه همچنین نشان داد که ذخیرة جامد اسپرم قوچ در ºc 15 با اضافه کردن ژلاتین به رقیق کننده نسبت به رقیق کننده های مایع معمولی باعث افزایش قدرت زنده مانی و توانایی نفوذپذیری در شرایط آزمایشگاهی می شود. بنابراین ذخیرة جامد اسپرم یک روش مناسب و مفید برای حفاظت منی تازة گوسفند در طی یک دورة زمانی می باشد.

 

 

مقدمه:

اخیرا تلقیح مصنوعی در گوسفند بدلیل کاهش باروری بعد از تلقیح گردن رحمی با منی منجمد شده ، کمتر مورد توجه قرار می گیرد. تلقیح درون رحمی (لاپاراسکوپی)،باعث افزایش نرخ باروری می شود ولی بدلیل هزینة بالا و زمان بر بودن و نیاز به وسایل و لوازم خاص، چندان مورد استفاده قرار نمی گیرد. استفاده از منی سرد شده ، عملی، ارزان، آسان و از لحاظ اقتصادی باصرفه تر می باشد. علیرغم مطالعات متعدد بر روی ارزیابی رقیق کننده های مایع، اما هنوز موانع زیادی در استفاده از منی سرد شده  در برنامه های تلقیح مصنوعی وجود دارد. در کشورهای مدیترانه ای برای حفاظت منی گوسفند در ºc 15جهت تلقیح مصنوعی، از شیر بعنوان رقیق کنندة اصلی استفاده می شود. از رقیق کننده ها جهت حفظ توانایی باروری اسپرم بعد از 10-8 ساعت استفاده می کنند. با افزایش ویسکوزیتة محیط و در نتیجه کاهش تحرک اسپرم، استفاده از مکمل هایی مثل ژلاتین در رقیق کننده ها را ضروری می کند که این کار برای اولین بار در گوسفند مورد ارزیابی قرار گرفت. در اکثر مطالعات صورت گرفته بیشتر از خرگوش استفاده شده است. اضافه نمودن ژلاتین (1گرم در 100 میلی لیتر رقیق کننده روی زنده مانی و سلامت آکروزوم  اسپرم هایی که برای 72 ساعت ذخیره شدند اثر مثبتی دارد. در گزارشات قبلی نیز به ذخیرة جامد اسپرم خرگوش در رقیق کننده با مکمل ژلاتین و توانایی باروری تا 72 ساعت بعد از ذخیره شدن اشاره شده است. هدف از این آزمایشات ارزیابی اثرات سودمندی احتمالی ذخیرة جامد(بوسیلة اضافه کردن ژلاتین به رقیق کننده) منی قوچ در ºc 15 روی تحرک و سلامت غشا اسپرم در یک دورة زمانی 48 ساعته ومیزان  نفوذپذیری در شرایط آزمایشگاهی بعد از 24 ساعت ذخیره می باشد.

مواد و روش ها

رقیق کننده مایع استاندارد(شاهد) با شیر حرارت دیدة دارای 7. 0% چربی و آنتی بیوتیک (پنی سیلین 2000 واحد بین المللی در میلی لیتر و استرپتومایسین4/0میلی گرم در میلی لیتر) رقیق شد. رقیق کننده ژل با اضافه کردن 5/1% ژلاتین نوع A و ژل قوی بلومºC240 در رقیق کننده شیر مایع استاندارد بدست آمد.

جمع آوری و آماده سازی

در تمامی آزمایشات منی از چهار قوچ بالغی که در مرکز تحقیقاتی ایالت متحده نگهداری می شدند، بوسیلة واژن مصنوعی جمع آوری شد. مجموع انزال های دوم 4 قوچ جهت از بین بردن اختلافات فردی با هم مخلوط شدند. نمونه های منی پس از رقیق شدن و رسیدن به غلظت نهایی 106*400 اسپرم در هر میلی لیتر در نی های 25/0 میلی لیتری پر شده و در کانتینر ºC 15 ذخیره شدند. از درجه حرارت ºC 30برای ژل و رقیق کننده پایه در هنگام رقیق کردن استفاده شد.

ارزیابی نمونه های اسپرم ذخیره شده:

تغییرات کیفی اسپرم در 24،2،0 و48 ساعت بعد از ذخیره در ºC15مورد بررسی قرار گرفت. قبل از آنالیز جهت

یخ گشایی همة نمونه ها برای مدت 2 دقیقه در آب ºC 37 قرار گرفتند. حرکت پیشرونده اسپرم بعد از رقیق شدن

20:1 نمونه ها با استفاده از میکروسکوپ مجهز به صفحة گرم مورد ارزیابی قرار گرفت. درصد حرکت پیشرونده اسپرم با استفاده از میکروسکوپ با بزرگنمایی 100 ارزیابی شد. ارزیابی اسپرم با استفاده از روش (CFDA/PS)  صورت گرفت. برای هر تیمار جهت تعیین درصد پایداری، با استفاده از میکروسکوپ فلورسانسی لیسا در مجموع 200 سلول اسپرم شمارش شد. فلورسانس مثبت نشان دهندة غشا سالم و پروپیدیوم یدید مثبت نشان دهندة غشا آسیب دیده محسوب شد.

تست پایداری حرارتی (TRT) با استفاده از انکوباسیون اسپرم در آب ºC 37  صورت گرفت. برای ارزیابی تغییرات زنده مانی و تحرک در طول دورة 2 ساعت انکوباسیون از هر تیمار، 3 نمونه مورد آنالیز قرار گرفت.

TRT: Thermal Resistance Test

تست نفوذپذیری

تخمدان  بره های 90-80 روزه، از کشتارگاه جمع آوری و به آزمایشگاه منتقل شدند. در عرض 30 دقیقه و در دمای ºC 37  و در درون نمک فیزیولوژیک 9/0  % کمپلکس اووسیت –کومولوس از فولیکول های با قطر 6-2 میلی متر بدست امد. اووسیت های کمتر از 3 لایه سلول های گرانولوزا و دارای سیتوپلاسم با ذرات یکنواخت با استفاده از استریو میکروسکوپ انتخاب و 4 بار در محیط(H – TC m199)  مورد شستشو قرار گرفت. کمپلکس اووسیت –کومولوس در بافر بیکربنات محیط کشت بافتی (TCM_199) که شامل 10% سرم جنین گوساله، 10 واحد بین المللی در میلی لیتر گونادوتروپین کوریونیک انسان، 5 واحد بین المللی در میلی لیتر گونادوتروپین کوریونیک اسب، 5 درصد Co2 و در دمای ºc5/38 بالغ شد.

24 ساعت پس از بلوغ، سلول های کومولوس که کمپلکس اووسیت –کومولوس را احاطه کرده بودند با استفاده از 300 واحد بین المللی در میلی لیتر آنزیم هیالورونیداز به طور کامل آزاد شدند. اووسیت های بالغ بطور تصادفی در 3 گروه ،40-30 اووسیتی  قرار گرفتند و به طور جداگانه و در 4 ظرف حاوی 4 میلی لیتر محیط کشت باروری با یک لایة روغن پارافین نگهداری شدند. محیط کشت باروری حاوی بافر بیکربنات سنتتیک مایع تخمدانی و 2% سرم گوسفندان فحل می باشد. اسپرم های متحرک را پس از تعیین رقیق کرده تا به غلظت 106×2 برسد و سپس با 40-30 اووسیت برای 18 ساعت در یک محیط مرطوب با 5% Co2 و در دمای ºc5/38 انکوباسیون می کنیم. در انتهای انکوباسیون اووسیتها را با اسپرم ها ترکیب و در اتانول فیکس کرده و بمدت 10 دقیقه با یک میکروگرم در میلی لیتر Hoechst 33342 رنگ  نمودیم. فرض بر این بود که زیگوت هایی که جفتگیری شده اند را در گلیسرول 100% قرار داده و بوسیلة میکروسکوپ فلورسانس  مورد ارزیابی قرار گیرد. هنگامیکه دو یا چند پیش هسته در اووسیت ها به وضوح مشاهده شود دلیل بر نفوذپذیری می باشد.

طرح آزمایشی

آزمایش اول:

منی تازه چهار قوچ جمع آوری و با هم مخلوط شده و برای مدت دو روز و در ºC15 ذخیره شد. تحرک اسپرم، سلامت غشا و مقاومت حرارتی بعد از 24،2 و 48 ساعت در دو گروه،  شاهد  و گروه نمونه های ژل مورد ارزیابی قرار گرفت.

آزمایش دوم:

منی جمع آوری شده از 4چهار قوچ برای 2 یا 24 ساعت در رقیق کننده گروه کنترل و برای 24 ساعت در رقیق کننده زل ذخیره شد. بعد از ذخیره، اسپرم ها سانتریفیوژ شدند واسپرم ها ی زنده برای IVF  استفاده شدند.

آنالیز آماری

برای تعیین تفاوت بین تحرک اسپرم، سلامت غشا و مقاومت حرارتی میان رقیق کننده ها از آنالیز واریانس مدل خطی استفاده شد. سرعت نفوذپذیری اسپرم با استفاده از کای اسکوئر مورد آنالیز قرار گرفت. برای انالیز آماری از رویة SPSS12 اسفاده شد.

TCM: Tissue culture medium

 

نتایج:

آزمایش اول:

همة نمونه های منی در رقیق کننده ژل و در ºC15 به صورت جامد ذخیره شدند. جدول یک اثرات مکمل های ژلاتین و زمان ذخیره را روی تحرک اسپرم و سلامت غشا  نشان می دهد. نسبت سلول های متحرک و غشا سالم بعد از یک دورة 24 ساعته و 48 ساعته ذخیره ای، برای رقیق کننده های مایع در مقایسه با نمونه های رقیق شده با ژل به طور معنی داری پائین بود. بعد از 2 ساعت ذخیره نسبت اسپرم های با غشا سالم به طور معنی داری در گروه کنترل نسبت به گروه زل پائینتر بود. در صورتی که میزان تحرک در هر دو گروه یکسان بود. در گروه ژل تحرک اسپرم تا 48 ساعت پس از ذخیره حفظ شد در صورتیکه در گروه کنترل یک کاهش معنی داری بعد از 24 ساعت ذخیره مشاهده شد.

جدول 1- اثرات مکمل های ژلاتینی و زمان ذخیره روی تحرک اسپرم و سلامت غشا منی گوسفند

مدت زمان ذخیره

رقیق کننده ها

صفات منی

48

24

2

0

 

 

41/1±33/55

88/1±78/69

11/1±70/64

32/1±27/71

11/1±94/73

32/1±77/73

16/1±.00/75

08/1±95/75

شاهد

ژل

نرخ تحرک(%)

06/1±84/56

43/1±32/70

84/0±55/65

00/1±01/70

84/0±61/71

00/1±55/74

00/1±25/75

95/0±30/75

شاهد

ژل

سلامت غشا(%)

 

 

جدول 2- بعد از 2 ساعت انکوباسیون، درصد سلول های متحرک و غشا سالم به طور معنی داری در گروه کنترل نسبت به گروه ژل بعد از گذشت 48-24 ساعت ذخیره پائین بود

 

 

مدت زمان ذخیره رقیق کننده ها صفات منی

48

24

2

0

 

 

39/1±14/44

87/1±45/51

09/1±12/52

32/1  ±  61/59

12/1±21/66

30/1 ±   65/70

16/1±12/74

08/1±   89/74

شاهد

ژل

نرخ تحرک(%)

 

09/1  ±  13/49

41/1  ±   15/63

84/0  ±  42/57

02/1 ±   38/65

82/0±   12/65

01/1    ± 42/71

00/1 ±   46/72

95/0±   62/73

شاهد

ژل

سلامت غشا(%)

 

 

آزمایش دوم:

جدول 3 سرعت نفوذپذیری اسپرم ها بعد از 24،2 ساعت ذخیره در رقیق کننده کنترل و بعد از 24 ساعت در رقیق کننده ژل را،

نفوذپذیری(%)

اووسیت

 

(80/47) 76

161

کنترل،2 ساعت

(26/37)60

159

کنترل، 24 ساعت

(82/51) 85

164

ژل، 24 ساعت

 

نرخ باروری بعد از گذشت 24 ساعت از زمان ذخیره در رقیق کنندة کنترل در مقایسه با رقیق کننده حاوی ژل به طور معنی داری کاهش یافت.

بحث

اثرات ذخیرة جامد اسپرم قوچ بر روی باروری و زنده مانی اسپرم با انجام این آزمایش برای اولین بار مورد ارزیابی قرار گرفت و سپس اثرات مدت زمان ذخیره در ºC15 روی تحرک و سلامت غشا اسپرم (در آزمایش اول) و روی نفوذپذیری در شرایط آزمایشگاهی (آزمایش دوم) گزارش شده. منی قوچی که در رقیق کننده با مکمل ژلاتین رقیق شد، نشان می دهد که ذخیره در وضعیت جامد و درC  º15 با استفاده از ژلاتین باعث بهبود تحرک و زنده مانی اسپرم قوچ ها می شود. همچنین با این کار ظرفیت پذیری اسپرم برای نفوذ به اووسیت ها نیز، بهبود می یابد. نتایج بدست امده از این مطالعه با نتایج ناجی و همکاران، لاپز – گایتوس و همکاران مطابقت داشت. که این محققین اثرات مثبت اضافه کردن ژلاتین بر روی زنده مانی و سلامت غشایی منی خرگوش را گزارش نمودند. در مطالعه ای که بر روی خرگوش انجام گرفت، سرعت حرکت اسپرم در رقیق کننده ژلاتین به طور وضوح مشاهده شد که احتمالا بخاطر افزایش ویسکوزیتة رقیق کننده می باشد. در مطالعة موجود اختلاف ویسکوزیتة محیط کشت با استفاده از رقیق سازی محیط (ایجاد محیط ایزوتونیک) قبل از ارزیابی منی به حداقل ممکن رسانیده شد. نمونه های منی طی یک مدت زمان 2 ساعت در ºC 37   انکوباسیون شده تا تغییرات تحرک و سلامت غشا مورد ارزیابی قرار گیرد.

سئوال اصلی که در اینجا بوجود می آید اینست که چگونه ژلاتین زنده مانی اسپرم را بهبود می بخشد؟

در طول مدت ذخیره در وضعیت مایع، سلول های اسپرم رسوب کرده و اینکار می تواند باعث نوسانات زیادی در PH  شده و در نتیجه باعث افزایش تولید متابولیت های سمی می گردد. در مقابل ذخیره در وضعیت جامد دو اثر مثبت دارد:

1- با کاهش تغییرات در وضعیت کشت از رسوب سلول های اسپرم جلوگیری می کند.

2- با کاهش تحرک اسپرم ها و در نتیجة آن کاهش نیازها ی متابولیکی برای حرکت، باعث افزایش توان باروری اسپرم ها می شود.

نتایج IVF  بعد از 24 ساعت ذخیره در رقیق کننده ژل در مقایسه با رقیق کننده کنترل نشان داد که روش اول بهتر می باشد اگرچه اسپرمهای با غشای سالم دارای قدرت تحرک در هنگام رقیق شدن هستند ولی قابلیت باروری آنها به وضوح مشخص نمی باشد.

در این مطالعه نفوذپذیری اسپرم ها نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. بطوریکه منی ذخیره شده با رقیق کننده کنترل در طی 2 ساعت ذخیره نسبت به منی ذخیره شده با رقیق کننده ژلاتینی (24 ساعت ذخیره) از قدرت نفوذپذیری پائینی برخوردار بود (48% در مقابل 52%).

میزان باروری نیز در گروه رقیق کنندة کنترل به طور معنی داری نسبت به گروه رقیق کنندة ژلاتینی پائین بود. میزان باروری اسپرم ها بوسیلة فاکتورهای مختلفی از جمله تحرک، زنده مانی، ظرفیت پذیری و فعالیت آکروزوم در مجرای تولید مثلی دام ماده تحت تاثیر قرار می گیرد. لذا برای داشتن یک برنامة تلقیح مصنوعی موفق استفاده از یک رقیق کنندة مناسب که بتواند این فاکتورها را در طی فرایند انجماد حفظ نماید، ضروری می باشد.

بهبود قدرت تحرک، سلامت غشا اسپرم و نتایج IVF اسپرم های ذخیره شده در رقیق کنندة حاوی ژلاتین نشان می دهد که رقیق کننده های جامد با ایجاد تغییراتی، از منی تازة گوسفند در طول یک دورة مشخص حفاظت می کند. نتایج بدست آمده از این تحقیق به خوبی نشان داد که ذخیرة جامد در ºC 15، زنده مانی و نفوذپذیری اسپرم را به طور معنی داری بهبود می بخشد.

 

منبع : پارس بیولوژی

 

نظر خود را اضافه کنید.

ارسال نظر به عنوان مهمان

0 محدودیت حروف
متن شما باید بیشتر از 5 حرف باشد
نظر شما به دست مدیر خواهد رسید
  • هیچ نظری یافت نشد